Q:如何储存抗体？
A:储存抗体的条件以说明书为准，一般推荐放在4度,避免犯反复冻融。
Q:如何分装抗体？
A:为避免反复冻融,Novus推荐在储存前先分装抗体.分装体积不小于20ul,以避免抗体被微管吸附.作为选择之一,也可以BSA进行1:2 – 1:20 的稀释.加入的蛋白可稳定抗体溶液.在进行稀释前,稀释液必须过滤消毒。
Q：NOVUS的产品说明书中，列举的应用中IHC, IHC-P, IHC-F分别代表什么意思？
A：NOVUS的产品说明书中，列举的应用中如标注“IHC,IHC-P”，表明该产品只能应用石蜡包埋的样品检测；如果标注的是“IHC,IHC-F”，表明该产品只能应用于冰冻切片的样品检测；如标注了“IHC,IHC-P,IHC-F”，表明该产品既可应用于石蜡切片，也可应用于冰冻切片的样品。
Q:如果应用和种属在说明书上未列出，怎么办？
2.种属未列示时，应比较免疫原和感兴趣的蛋白的同源性，如同源性高于85%，表明该抗体可能会与感兴趣的种属蛋白反应。但是即使同源性很高，Novus也不对抗体的表现负责。
Q:如何正确选择合适的二抗产品?
A:选择合适的二抗是要根据您使用的一抗决定的。一般的规则是二抗的应用种属必须是您使用的一抗的宿主。比如，如果您使用的一抗是小鼠单克隆抗体，那么您就需要选择一个抗小鼠的二抗。
Q:Western blotting一般用于什么样的实验？
A:Western blotting是一个用于蛋白质分析的常规技术，它可以从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而半定量或定性（无法绝对定量）的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。另外，Western blotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，并结合组分分离技术，检测目标蛋白的定位情况，成为免疫荧光实验的补充。
Q:如何较好的设置western内参？
A:内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlotting显色或者发光体系是否正常。
常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。
另外，为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如β-actin、GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）。
Q:为什么western blot band条带的大小和预测的分子量大小不同?
A:在Western Blotting分析中，蛋白在胶中的迁移情况是依据分子量大小来决定的。但即使是这样，Western Blot得到的条带大小依然会和预计的分子量大小有出入。大部分常见的原因如下：
1.翻译后修饰—比如蛋白的磷酸化，糖基化等，这些都会增加蛋白的分子量大小。
2.翻译后剪切—比如很多蛋白首先被合成为前体形式，然后通过剪切获得生物学活性，比如pro-caspases。
3.剪接变异体—相同的基因，经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。
4.相对电荷—氨基酸的组成 (带点 vs 不带电)
5.多聚体—比如蛋白二聚体。但是尽管相互作用很强的蛋白会出现分子量偏高的条带，不过通常在还原（reducing）的条件下不会有问题。
Q:免疫组织（细胞）化学实验如何选择固定剂？
A:固定剂主要有两类：一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等。它们通过强烈脱水变性蛋白，同时它们也能够溶解脂类物质，因此产生通透效应。另一类为交联剂，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它们导致细胞内分子相互连接成网状结构，从而维持在原位上。这两类固定剂各有优缺点，交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但交联可能会破坏一些细胞组分的抗原性。同时交联剂固定的细胞需要通透处理，才能让抗体穿越膜结构与胞内抗原结合。醇类固定的优势在于蛋白变性完全，对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。醇类固定的细胞不需要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法，先要考虑所检测抗原在细胞中的定位，通常膜组分的蛋白需要用多聚甲醛固定。其他蛋白往往凭经验选择固定剂，可以试用两种方法，然后选择较好的一种。
Q:在做免疫荧光、免疫组织（细胞）化学实验时该如何设置对照？
A:1.阴性对照：阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色，当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原的细胞，例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。但这样的标本不一定存在或很难找到，常见的阴性对照也可以是针对一抗的PBS对照或来自同一种属动物的血清对照。
2.阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，这种阳性对照可验证Protocol，排除实验过程中出现的差错。另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。同时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签，如Flag, Myc, His tag等。
Q:什么是免疫荧光双标记，如何进行荧光双标实验？
A:免疫荧光双标记（Double Immunofluorescence）是用两种不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。标记这两种抗体的荧光素具有不同的颜色（激发和发射波长不同），通过荧光显微镜可以在同一细胞上分别观察到两种抗原，并可通过图像处理软件将它们同时呈现在一张图片上。
由于在同一个样本使用两种染料，为此就要求每一种检测试剂仅能识别一种抗原。主要有两种方法能够达到这一目的。最确定的方法就是直接标记一抗，如其中一种标记FITC，另一种标记Texas红，一般会有满意的结果。第二种方法是应用两套种属特异性的检测试剂。在进行这类进行荧光双标前，最好先验证单标对特定组织或细胞是有效的。在操作上与单标方法并无不同，但两种一抗必须来源于不同种属的动物，且两种二抗不能存在交叉反应。
Q:免疫荧光实验中用于标记抗体的荧光素有哪些，在选择上要考虑的因素有哪些？
A: 以下列举几种常用的荧光素：
1. FITC（Fluorescein） Excitation 495nm，Emission 525nm，黄绿色荧光；
2. Rhodamine (TRITC) Excitation 552nm，Emission 570nm，橙红色荧光；
3. R-Phycoerythrin (PE) Excitation 488nm，Emission 578nm，橙红色荧光；
4. Texas Red Excitation 596nm，Emission 620nm，红色荧光。
选择荧光素主要考虑以下几点：
①高消光系数（extinction coefficient）和光子产量（Quantum yield），这意味着光捕获能力强和效率高；
②光稳定性较好；
③与常见光源和滤光器匹配性较好；
④不干扰抗体反映；
⑤水溶性以及pH稳定性。此外，还需要考虑到是否有毒性以及荧光素的颜色是否与背景颜色反差大对比鲜明等。
Q:免疫酶标组织（细胞）化学实验中常用的显色液有哪些，各自特点是什么？
A:1.DAB（Diaminobenzidine；3，3-二氨基苯联胺）显色液
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明，半永久保存，且其终产物具嗜饿性，既可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，适于电镜下确定抗原存在的部位。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2.CN（4-Cl-1-Naphthol，4-氯-1-萘酚）显色液
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。
3.AEC（3-amino-9-ethyl-carbozole, 3-氨基-9-乙基卡唑）显色液
该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。AEC染色后的颜色比DAB好看，但是灵敏度比DAB低，而且保存时间短，易褪色。
4.TMB显色液
TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。
5.BCIP/NBT显色液
是碱性磷酸酶的显色底物。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl -phosphate）。NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。
Q:如何增强IHC/ICC/IF实验的特异性染色，减少非特异性染色？
A:为了获得高质量的结果，在免疫染色中既要注意增强特异性染色，也要尽可能的减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题：
1.增强特异性染色的方法
⑴蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。
⑵合适的抗体稀释度：抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子远远多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。因此，必须使用一系列稀释或作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。
⑶稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。
⑷孵育时间：大部分抗体孵育时间为30-60min，必要时可4℃过夜（约18h）。温育的温度常用37℃，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳。37℃可增强抗原抗体反应，适用于多数抗体染色，但应注意在湿盒中进行，防止切片干燥而导致失败。
⑸多层染色法：对弱的抗原可用间接法（双层）、PAP和ABC法（三层）、四或五层PAP法或ABC法，或PAP和ABC联合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，获得良好结果。
⑹显色增敏剂的应用，如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，可提高显色敏感度4倍。
2.减少或消除非特异性染色的方法
组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。
Q:RNA免疫沉淀（RIP），免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation，CO-IP），染色质免疫沉淀（Chromation immunoprecipitation，CHIP）的区别是什么？
A: 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质是否在生理条件下有相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。
染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecitation，ChIP）,是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它的基本原理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断进行PCR检测，可以知道目的蛋白与那些基因作用。
RNA免疫沉淀(RIP).是研究体内RNA与蛋白质相互作用的重要手段。它的基本原理是在生理状态下针对可以结合RNA的蛋白质进行免疫沉淀，然后通过分离抗体-Protein A/G beads复合物中的RNA成份，最后通过基因芯片或者其它手段检测目的RNA。
由此可见，CO-IP和CHIP以及RIP都是基于IP的基本原理去实现不同的研究目的，CO-IP主要是研究目的蛋白X和与之发生相互作用的蛋白Y之间的作用关系；而CHIP主要是研究目的蛋白X和与之发生相互作用的DNA片段Y之间的作用关系；RIP主要是研究RNA结合蛋白和RNA之间的结合。这也就决定了在进行IP，CO-IP和CHIP以及RIP实验时时操作步骤和涉及的缓冲液配方都有所不同。
Q:免疫沉淀，免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation，CO-IP），染色质免疫沉淀（Chromation immunoprecipitation，CHIP），RNA免疫沉淀（RIP）在实验操作中所要注意的关键点分别是什么？
A:免疫沉淀：因为免疫沉淀的目的主要是通过抗体和目的蛋白相互作用从而捕获目的蛋白，所以实验中要注意的关键点是抗体和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗体的结合能力，目的蛋白和抗体的可接触性两个因素影响。所以免疫沉淀实验中的关键因素是抗体的选择以及裂解缓冲液中的配方。对于前者而言，抗体所针对的作用表位必须处于目的蛋白表面，对抗体结合力的要求和免疫印迹或者免疫荧光相比要高得多；对于后者而言，主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在不破坏目的蛋白天然构象的情况下（不影响目的蛋白和抗体的相互作用效果）将目的蛋白从细胞局部定位（比如位于某些细胞器中）中有效释放出来。
免疫共沉淀：免疫共沉淀的目的是通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获目的蛋白复合物，最终检测目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用。所以实验中要注意的关键点和免疫沉淀相比，除了要注意抗体和目的蛋白相互作用的效果外，还要注意目的蛋白复合物的完整性。后者主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在有效释放目的蛋白复合物进入可溶相的情况下不破坏目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用。所以，免疫共沉淀实验中的关键因素除了抗体的选择外，裂解缓冲液配方中的去垢剂的成分和浓度对免疫共沉淀实验的成功与否至关重要，其选择相比免疫沉淀实验而言，要求更严格。
染色质免疫共沉淀：染色质免疫沉淀的主要目的通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获和目的蛋白有相互作用的DNA片段，最终检测目的蛋白和DNA片段的相互作用。因此，实验中要注意的关键点和前二者（免疫沉淀和免疫共沉淀）有所不同。因为在实验中中蛋白质-DNA复合物的维持需要依靠多聚甲醛的交联作用，所以目的蛋白的许多表面表位也在交联过程中丧失。因此，除了后续的基本操作和免疫沉淀以及免疫共沉淀有些许不同，有额外需要注意的是向外，其对抗体的要求要比免疫沉淀和免疫共沉淀高得多，相对而言，裂解缓冲液的成份并不是关键因素。
Q:该选择什么样的抗体进行免疫沉淀，免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation，CO-IP），染色质免疫沉淀（Chromation immunoprecipitation，CHIP）及RNA免疫沉淀（RIP）实验？
A:在所有免疫沉淀相关实验中，抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验（WB和IF等）要低得多，所以对抗体的亲和力相对其它实验(WB和IF等)提出了很高的要求，这就需要使用高亲和力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时，由于免疫沉淀相关实验主要是在生理条件性进行，所以需要抗体识别蛋白的天然表面构象，因此选择的抗体其针对的抗原决定蔟需要暴露在蛋白表面。这些因素对制备能成功应用于IP实验的抗体提出了很高的要求：
a.用于免疫的蛋白抗原其构象需要尽量接近目的蛋白的天然构象或者用于免疫的多肽尽量暴露在目的蛋白的表面。获得接近天然构象的蛋白抗原的途径有很多，主要有天然提取，原核表达重组蛋白以及真核表达重组蛋白三种方式。
b.亲和力要比普通的抗体应用要求高得多。多克隆抗体由于可以结合目的抗原的多个抗原决定簇，所以在亲和力方面是首选。但考虑到特异性，获得单克隆抗体群是更好的选择。
