Q1. PCR无扩增条带的原因有哪些?
A1. 模板:(1)模板中含有杂蛋白、Taq酶抑制剂等
(2)模板核酸变性不彻底
(3)模板降解
引物: (1)引物合成质量不佳
(2)引物降解
(3)引物设计不合理(如引物长度不够,引物之间形成二聚体等)
Mg2+浓度:Mg2+浓度偏低
退火温度:退火温度过高,影响引物与模板的结合
延伸时间:延伸时间短
Q2. TA克隆时没有或极少量菌落的原因有哪些?
A2. 感受态细胞效率低
连接酶失效
PCR产物加A比例过低
PCR产物量不足
PCR产物中含有阻碍TA连接反应的杂质
UV照射过久导致PCR产物变性
载体3’末端T降解
抗生素用错或浓度过高